腺病毒包裝技術(shù)中的Z大難點

 　　在目前的腺病毒包裝技術(shù)中，一直困擾著技術(shù)人員的一大難點就是如何將外源基因表達框或者外源的shRNA表達框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上，如果是用現(xiàn)在比較常規(guī)的方法即酶切-連接的方式將外源基因或者shRNA表達框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上來進行操作，往往成功率比較低，原因在于：我們知道，腺病毒骨架載體比較大（~30kb），而且載體中的一些常用酶切位點幾乎都有多個，這就造成了低成功率的現(xiàn)象。為此，我們需要采用另外一種方法對其進行包裝即用同源重組的方法將外源基因或shRNA表達框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上。
　　重組腺病毒的包裝制備：重組腺病毒是從由侵染色斑組成單位（pfu）中分離獲得的。一個單色斑是線性載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后在20×15 cm板上由293A細胞連續(xù)侵染后被挑選和擴增形成的。重組腺病毒可通過超速離心純化，并測定滴度及進行PCR鑒定。純化后重組腺病毒的滴定濃度為1010pfu/ml，獲得的量為2-4 ml。
　　作為現(xiàn)在比較可靠的重組病毒表達系統(tǒng)，腺病毒可用于哺乳細胞中瞬時及高水平地表達shRNA或目的蛋白，并具有以下優(yōu)勢：
　　1、腺病毒可感染一系列哺乳動物細胞，除可感染幾乎所有人的細胞類型外，還可感染包括大鼠、小鼠、兔、豬、羊、猴、雞等物種。
　　2、因腺病毒的感染不依賴細胞周期，故其既可以感染增殖細胞也可以感染非增殖細胞，且病毒滴度高，可用于動物水平的實驗。
　　3、腺病毒具有嗜上皮細胞特性，因大多數(shù)腫瘤細胞均屬于上皮細胞，這使得腺病毒非常適合應用于基因治療領(lǐng)域。
　　4、有較好的生物安全性。腺病毒攜帶的基因不會整合到宿主細胞基因組中；實驗中雖然會有一定機率出現(xiàn)RCA（即復制型腺病毒），但由于大多數(shù)成人體內(nèi)都有針對腺病毒的抗體，所以一般危害不大。
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